Năng lượng trung bình là gì? Nghiên cứu khoa học liên quan

Giới thiệu

Quang phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) là kỹ thuật phân tích phi phá hủy, sử dụng hiện tượng cộng hưởng của các hạt nhân mang spin trong từ trường mạnh để khảo sát cấu trúc phân tử và môi trường hóa học. Từ khi được phát triển vào năm 1946 bởi Bloch và Purcell, NMR đã trở thành công cụ chủ lực trong hóa học hữu cơ, hóa sinh và dược phẩm, giúp xác định cấu trúc tinh thể, theo dõi phản ứng động học và nghiên cứu tương tác ligand–protein ở cấp độ nguyên tử.

NMR có khả năng đo trực tiếp trên mẫu lỏng hoặc mẫu rắn mà không cần tinh sạch hoàn toàn, cung cấp đồng thời dữ liệu định tính và định lượng. Độ nhạy và độ phân giải cao của NMR cho phép phân biệt các đồng phân, xác định vị trí thế nhóm chức và thậm chí tái tạo mô hình 3D của protein và axit nucleic. Sự phát triển của phổ đa chiều (2D, 3D NMR) và công nghệ tăng sáng tín hiệu (hyperpolarization) tiếp tục mở rộng phạm vi ứng dụng, từ phân tích hỗn hợp phức tạp tới khảo sát vật liệu nano.

Ưu thế nổi bật của NMR so với các phương pháp khác là khả năng cung cấp thông tin về cả cấu trúc và động học: các tham số như hóa shift, coupling constant và thời gian thư giãn (T₁, T₂) phản ánh chi tiết môi trường electron và dao động phân tử. Trong lĩnh vực dược, NMR hỗ trợ đánh giá độ tinh khiết, xác định tạp chất và khảo sát độ ổn định của hoạt chất; trong hóa học vật liệu, NMR solid-state phân tích ma trận polymer, vật liệu xốp và pin ion-lithium.

Định nghĩa “Quang phổ NMR”

Quang phổ NMR là đồ thị tín hiệu thu được sau khi biến đổi Fourier (FT) tín hiệu Free Induction Decay (FID) theo tần số, biểu diễn cường độ tín hiệu dưới dạng hàm của hóa shift δ (ppm). Mỗi đỉnh (peak) trên phổ tương ứng một môi trường hạt nhân riêng biệt, giúp phân biệt các nhóm hóa học và cấu trúc liên kết.

Hóa shift δ được tính theo công thức:
$δ = \frac{ν - ν_{\mathrm{ref}}}{ν_{\mathrm{obs}}}\times10^6\quad(\mathrm{ppm})$
với ν là tần số cộng hưởng của mẫu, ν_ref tần số tham chiếu (thường là TMS), và ν_obs tần số vận hành máy. Đây là đại lượng không phụ thuộc trực tiếp vào cường độ từ trường, cho phép so sánh dữ liệu giữa các máy khác nhau.

Các tham số quan trọng khác gồm:

• Coupling constant J (Hz): thể hiện tương tác spin–spin qua liên kết cộng hóa trị;
• Độ rộng đỉnh (line width): liên quan đến thời gian thư giãn T₂ và tính đồng nhất của mẫu;
• Tỷ lệ tích phân (integral): tỷ lệ diện tích dưới đỉnh phản ánh số lượng hạt nhân tương ứng.

Kết hợp các thông số này, người phân tích có thể xác định vị trí gắn nhóm, kết cấu đa vòng và cấu hình stereochemistry, xây dựng bản đồ liên kết nguyên tử một cách chính xác.

Nguyên lý hoạt động

Khi đưa mẫu chứa hạt nhân có spin (¹H, ¹³C, ¹⁵N…) vào từ trường B₀ mạnh, các spin phân bố giữa mức năng lượng thấp (m = +½) và mức năng lượng cao (m = –½). Hiệu năng lượng giữa hai mức là:

$ΔE = γ \hbar B_0$

với γ hệ số từ động và ħ hằng số Dirac. Khi chiếu xung RF có tần số ν = γB₀/2π, spin hấp thụ năng lượng và chuyển sang trạng thái kích thích (cộng hưởng). Sau khi tắt xung, spin trở về trạng thái cơ bản, phát ra tín hiệu FID được thu bởi cuộn thu trong đầu dò.

Để chuyển FID thành phổ tần số, sử dụng biến đổi Fourier (FT). Đặc điểm tín hiệu phụ thuộc vào hai quá trình thư giãn:

• T₁ (longitudinal relaxation): phục hồi thành phần magnetization dọc theo B₀;
• T₂ (transverse relaxation): mất pha giữa các spin, ảnh hưởng đến độ rộng đỉnh.

Phương trình Bloch mô tả động học spin trong và ngoài cộng hưởng, giúp thiết kế các pulse sequence cho phổ 1D và 2D, như COSY, HSQC, NOESY để khảo sát tương tác spin–spin và khoảng cách không gian.

Thiết bị và thành phần chính

Máy NMR hiện đại bao gồm ba cụm thiết bị chủ chốt:

• Từ trường siêu dẫn: nam châm superconducting tạo B₀ ổn định, thường 300–1 000 MHz cho ¹H NMR, tương đương 7–23 Tesla.
• Đầu dò RF (Probe): chứa cuộn transmitter–receiver ngập mẫu, có thể là probe thường hoặc cryogenic (cryoprobe) để giảm noise và tăng độ nhạy 2–3 lần.
• Bộ điều khiển xung và xử lý tín hiệu: pulse generator, RF amplifier, receiver và máy tính chạy phần mềm xử lý phổ (TopSpin, MNova).

Thành phần	Chức năng	Thông số điển hình
Nam châm siêu dẫn	Tạo B0 ổn định	7–23 T; ±0.001 ppm đồng nhất
Đầu dò RF	Phát/xử lý xung	300–1 000 MHz; cryo/non-cryo
Bộ gradient	Xung gradient cho phổ 2D	10–50 G/cm
Phần mềm FT	Biến FID thành phổ	TopSpin, MNova

Chuẩn bị mẫu và điều kiện đo

Mẫu NMR thường được hòa tan trong dung môi deuterated (D₂O, CDCl₃, DMSO-d₆) để giảm tín hiệu nền từ ^1H của dung môi. Nồng độ mẫu lý tưởng nằm trong khoảng 1–10 mM, đảm bảo tín hiệu đủ mạnh mà không gây quá tải đầu dò. Trước khi đo, mẫu được lọc và quay ly tâm để loại bỏ tạp chất và bong bóng khí.

Ống NMR tiêu chuẩn có đường kính trong 5 mm hoặc 3 mm, chất liệu thủy tinh chịu nhiệt, phải được làm sạch kỹ và sấy khô. Việc giữ nhiệt độ mẫu ổn định (thường 25 °C ±0.1 °C) là yếu tố then chốt để đảm bảo hóa shift và thời gian thư giãn T₁, T₂ không thay đổi qua các lần đo.

• Số lần quét (number of scans): 16–64 cho phổ ^1H 1D, 128–512 cho ^13C 1D, 256–1 024 cho các phổ 2D.
• Thời gian ngắt trường (relaxation delay): 1–5 s tùy kích thước và T₁ của mẫu.
• Shielding và shim: điều chỉnh đồng nhất từ trường tự động qua auto-shimming để đạt đường nền phẳng và độ phân giải cao.

Hóa shift và hiệu ứng môi trường

Hóa shift δ phản ánh mức độ che chắn electron quanh hạt nhân và thường phân bố theo ppm. Trong ^1H NMR, phạm vi δ 0–12 ppm chia thành vùng aliphatic (0–3 ppm), ankenic/aromatic (5–9 ppm) và dạng acid/aldehyde (9–12 ppm). Đối với ^13C NMR, vùng δ 0–220 ppm cho phép phân biệt carbon aliphatic, sp^2, carbonyl và nitrile.

Hiệu ứng che chắn (shielding) và xói mòn che chắn (deshielding) được điều khiển bởi các nhóm thế electron-donating hoặc electron-withdrawing, cũng như hiệu ứng anisotropy của vòng thơm. Ví dụ, proton gắn vào carbon cạnh nhóm nitro thường xuất hiện ở 8–9 ppm do deshielding mạnh.

Loại proton	Phạm vi δ (ppm)	Điển hình
Aliphatic CH3	0.8–1.2	Toluene methyl
Aliphatic CH2	1.2–1.8	Ethyl group
Alkenic/Ar	5.0–9.0	Benzene ring
Aldehyde/Acid	9.0–12.0	Formyl, carboxylic

Tương tác spin–spin và đa dạng phổ đồ

Coupling constant J (Hz) đo cường độ tương tác spin–spin qua liên kết, giúp xác định kết nối nguyên tử. Đỉnh tuân theo quy tắc (n+1): n proton láng giềng sinh multiplet có n+1 thành phần.

• Doublet (J ~ 7 Hz) khi n = 1, triplet (J ~ 7 Hz) khi n = 2.
• Multiplet phức tạp khi proton tương tác với nhiều proton có J khác nhau.

Phổ 2D cung cấp thông tin kết nối chi tiết:

• COSY: xác định cặp proton láng giềng (through-bond coupling).
• HSQC: kết nối trực tiếp ^1H–^13C (one-bond correlation).
• HMBC: kết nối ^1H–^13C nhiều bước (two- và three-bond).
• NOESY/ROESY: tương tác không gian (<5 Å) giữa proton, hữu ích cho xác định cấu trúc 3D và đồng phân hình học.

Ứng dụng chính

NMR là công cụ mở rộng cho nhiều ngành:

• Hóa học hữu cơ: xác định cấu trúc hợp chất mới, đồng phân hình học và stereochemistry.
• Hóa sinh & Dược phẩm: phân tích protein, axit nucleic, tương tác ligand–protein và xác định tạp chất (PubMed NMR applications).
• Metabolomics: định lượng hàng trăm chất chuyển hóa trong mẫu sinh học, hỗ trợ chẩn đoán và nghiên cứu bệnh (Nat Biotech).
• Vật liệu & Polymer: khảo sát cấu trúc solid-state NMR, phân tích ma trận polymer, pin ion-lithium và composite.

Hạn chế và thách thức

Độ nhạy của NMR tương đối thấp so với quang phổ khối, đặc biệt với hạt nhân độ thiên vị thấp (¹³C, ^15N). Cần mẫu nồng độ cao và số lần quét nhiều, dẫn đến thời gian đo dài.

Chi phí đầu tư và vận hành cao, bao gồm máy siêu dẫn, chi phí cryogen (He, N₂) và bảo trì. Với mẫu rắn hoặc không đồng nhất, tín hiệu broaden và mất chi tiết cấu trúc.

• Kỹ thuật hyperpolarization (DNP, para-hydrogen) tăng độ nhạy nhưng phức tạp.
• Mẫu lượng nhỏ (<μL) yêu cầu đầu dò microcoil và microfluidic.

Hướng nghiên cứu tương lai

• Phát triển đầu dò microcoil, microfluidic NMR cho mẫu nano- to microliter (Anal Chem).
• Hyperpolarization ở nhiệt độ phòng và không cryogenic để tăng tính thực tiễn.
• Ứng dụng machine learning giải thích phổ tự động, dự đoán hóa shift và coupling từ cấu trúc in silico.
• Phổ NMR siêu nhanh (ultrafast NMR) thực hiện phổ 2D trong vài giây.

Tài liệu tham khảo

• Grant DM., Harris RK. Encyclopedia of Nuclear Magnetic Resonance; Wiley, 1996.
• Levitt MH. Spin Dynamics: Basics of NMR; Wiley, 2008.
• Claridge TDW. High-Resolution NMR Techniques in Organic Chemistry; Elsevier, 2016.
• Parigi G. et al. “Recent advances in dynamic nuclear polarization for NMR instrumentation, methodology and applications.” Chem. Rev., 2019. DOI: 10.1021/acs.chemrev.8b00306.
• National Institute of Standards and Technology. “NMR Resources.” NIST.